(2) Lac iS突变体
对i基因其他突变体的分析还说明这些突变实际上是影响到基因产物阻遏蛋白的结构状况。通过使lac i失活的突变，已经确定在阻遏物亚基上有两个结合位点：一个是识别操纵基因序列的DNA结合位点；另一个是与小分子诱导物相结合的诱导物结合位点。如菌株发生lac iS突变时，其iS基因产物阻遏蛋白由于构型改变，不能结合诱导物。因此，不论细胞内是否存在诱导物，阻遏物都不再被诱导而始终结合在操纵基因上，以致突变株丧失了合成酶系统的全部能力。这样的突变体又称为超阻遏突变体(super repression mutation)。即使让lac iS与lac i－菌株形成部分杂合子(iS/ i－)，也不会改变iC不能转录的遗传效应。而iS不仅对i－为显性，且对野生型(i＋)也是显性。
结论：阻遏物亚基上的两个结合位点
（1）与操作基因的结合位点
（2）与诱导物的结合位点
5、启动区P突变(P＋→P－)
RNA聚合酶没有结合位点，于是操纵子中所有的酶都不能合成，由此导致超阻遏型。
对影响启动子功能的突变体的研究分析，在-35区的下降突变是降低了闭合复合物的形成速率，但不抑制开放复合物的转换，而-10区内的下降突变虽不减缓闭合复合物的起始形成，但却使其转换成为启动状态延迟。由此可见—35序列的功能是为RNA聚合酶提供识别信号，而-10区序列则是使起始复合物由关闭状态转变成启动状态。
在Pribnow框与Sextama框之间，其序列的核苷酸成分并不十分重要，因为其中核苷酸发生替换对转录效率无明显影响。但是这两个共有序列之间的距离却至关重要。实验证明当两者之间距离为17bp时转录效率最高。天然启动子中这一段距离大多是15—20 bp。
6、总结
四、大肠杆菌乳糖操纵子的正调控
1、现象：
当E．coli以乳糖为唯一碳源时，lac操纵子可被乳糖诱导而表达,可是各培养基中同时加入葡萄糖时，细菌优先利用葡萄糖，只有录葡糖耗尽时，乳糖才能作为诱导物。这种现象称为分解物阻遏(catabolite repression)
当培养基中含有葡萄糖时就会阻止这些操纵子的功能，因此这些操纵子也称为葡萄糖敏感操纵子。
2、实验：
(1)cAMP（环化腺苷一磷酸，cyclic AMP）
| |
|
1965年，B Magasonik发现在大肠杆菌中也含有cAMP，而且菌株内cAMP的含量常随细胞的生理状态发生变化，即当细胞处于碳源饥饿条件下，cAMP水平显著提高，反之．在细胞生长的培养基中含有大量葡萄糖时，cAMP水平明显降低；乳糖操纵子也有类似的情况，只有当以乳糖为唯一碳源时，β—半乳糖苷酶的合成才增加。但是在以乳糖和葡萄糖为碳源时，如果加入cAMP，β—半乳糖苷酶的合成速率也会大大提高，可达到只用乳糖为碳源时的水平。这说明，菌株内，cAMP的浓度能影响到β—半乳糖苷酶的合成速率。
进一步的分析发现，这一过程还与一种诱导蛋白有关。
（2）cAMP-CAP复合体
分解物基因激活蛋白(catobolite gene activation protein，CAP)
cAMP受体蛋白(cAMP receptor protiein．CRP)
这是一种二聚体蛋白质，每个亚基含209个氨基酸残基，可起转录起始因子的作用，在有cAMP时，能使操纵子有效地进行转录。
(i) cya基因和crp基因的互补作用：
CAP单独存在时无活性，但它可被cAMP激活；cAMP腺苷酸环化酶基因突变（cya基因），酶无活性，cAMP不能合成；编码CAP蛋白的基因（crp基因）的突变，使CAP失活，都影响乳糖的利用，lac操纵子在没有葡萄糖时也不能表达。
结论：cAMP和CAP都是lac操纵子转录所必须的；二者结合成复合物，可同启动子结合。（体外的互补实验证实了crp +细胞的作用并分离出一个激活蛋白CAP）
(ii) CAP结合位点的结构：
一些物理化学的研究表明，CAP结构变化与cAMP的结合有关。采用保护降解法的分析，可知在lacc P区上游-72~-52核昔酸对处有一个CAP结合位点，但只有在有cAMP时，CAP才能结合于此位点。CAP结合位点中有一段对称反向重复序列：这一序列的第3位和倒数第3位的G／C对之一突变成A／T对后，也影响cAMP-CAP与它的结合，而成为启动子下降突变。
(3)lac操纵子的正调控机制
cAMP-CAP复合物与DNA结合改变了这一区段DNA次级结构，促进了RNA聚合酶结合区的解链。可能是cAMP-cAP先通过与RNA聚合酶结合，再与DNA结合，因而促进了RNA聚合酶与启动子的结合，从而增强了转录。
cAMP-CAP复合物的形成取决于细胞内cAMP的浓度，当以葡萄糖为能源时，由于其抑制腺苷酸环化酶的活性，ATP不能转化为cAMP，细胞内cAMP浓度降低，形不成CAP-cAMP复合物，因而乳糖结构基因不被转录。
最新动态
