力竭运动后不同时相大鼠心肌连接蛋白43 的变化

      关键词 　力竭运动; 心肌微损伤; 连接蛋白43

 

 

      Abstract 　Objective Inorder to investigate the changes in distribution and content of connexin 43 in myocardial tissue after exhausted exercise at different time points. Methods Ninety male Sprague - Dawley rats were divided into sedentary control group , single bout of exhausted exercise groups and 2 - week exhausted exercise groups. Rats were killed at 0h , 6h , 12h and 24h after exhausted exercise. Immunofluorescence technique and image - analysis method were used to study the changes in distribution and content of Cx43 in myocardial tissue. Results After single bout of exhausted exercise and 2 - week exhausted exercises, myocardial Cx43 distribution pattern at each time point revealed a remarkable change: from end - to - end distribution to side - to - side distribution predominantly. After single bout of exhausted exercise and 2 - week exhausted exercises, left ventricular and right ventricular myocardial Cx43 content at each time point was remarkable lower thancontrol group P < 0105 . after exhausted exercise , left ventricular and right ventricular myocardial cx43 content at each time showed no remarkable difference between two different exercise forms p>0105 .Conclusion Single bout of exhausted exercise and 2 - week exhausted exercise could result in degradation and change in distribution pattern of myocardial Cx43 , probably contributing to exercise - induced arrhythmia structurally.

      Key words　exhaustive exercise , heart micro - injury, connexin 43

 

      剧烈运动特别是超长时间的反复大强度运动和力竭运动导致机体心脏功能方面的严重医学问题已成为人们日益关注的焦点。 缝隙连接是直接连接邻近心肌细胞的跨膜通道 ,是心肌细胞间进行物质交换和信息交流的唯一通道 ,其结构的破坏可导致心电活动和心肌收缩功能的异常。心肌连接蛋白 43 Cx43 是十余个组成缝隙连接的连接蛋白家族成员中的一个 ,是心室肌中表达最多的连接蛋白。有学者研究发现 ,在心肌梗死的边缘地带 ,缝隙连接从细胞的端对端连接处转换到细胞的侧面,而且 Cx43 的数量也下降[1- 3] ;而另外的学者则发现缺血而非梗死的心肌组织亦有Cx43的降解和分布的改变[4 – 6]。在对于心律失常的研究中发现 ,在各种心脏疾病的心肌组织中都有类似的缝隙连接的改变 ,缝隙连接的分布模式的改变和数量的下降造成心肌细胞间电耦联的障碍从而引起心律失常[7 – 9]。

本研究建立了力竭游泳运动实验动物模型,观察实验大鼠在力竭运动后即刻、6 小时、12 小时和24 小时4个时相点心肌 Cx43 分布及含量的变化,试图为运动性心律失常发生机制的探讨提供实验依据[7 – 9]。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组

      健康雄性成年 SD 大鼠 90 只 维通利华公司提供 ,体重260 ±8g。大鼠随机分为9 组 ,其中一次力竭4 组 即刻、运动后 6h、12h 和 24h ,2 周反复力竭4组 即刻、运动后 6h、12h 和 24h ,对照 1 组 ,每组10 只。各组大鼠初始体重无显著性差异 P >0105 。国家标准啮齿动物饲料喂养 ,自由饮食。饲养环境为室温20 ±2 ℃,光照时间12 小时 ,相对湿度

40 %～55 %。

1.2 　实验方法

1.2.1 力竭游泳运动

       采用 PVC 特制泳池 ,规格为 116m ×018m ×1.2m,内壁光滑 ,水深约 60cm,超过大鼠身长 2 倍 ,控制水温在 30～33 ℃。运动组大鼠进入动物房后首先适应 3 天 ,然后进行 2 天适应性游泳运动20min/次 。反复力竭运动组每天 1 次力竭游泳运动 ,大鼠尾部负重体重的 3 %,每周运动 6 次 ,共 2周 ,每次运动时间不少于 2 小时;每次运动后 ,迅速用干毛巾擦干水分 ,电吹风吹干后 ,放回笼中休息;末次力竭运动后取材 ,力竭标准参照 Thomas 的报道[10] ,即大鼠连续沉入水中超过 10 秒 ,捞出后置于平面不能完成翻正反射。一次力竭运动组饲养两周后与反复力竭组同时进行一次性游泳运动 ,同样尾部负重为体重的 3 %,直至力竭。安静对照组不运动 ,与运动组同时取材。

1.2.2 　大鼠心肌取材

      一次和反复力竭运动组分别于运动后即刻、6h、12h、24h取材。大鼠腹腔注射 10 %水合氯醛 1ml/100g体重 麻醉后 ,开胸后迅速取出心脏 ,经灭菌生理盐水清洗后 ,滤纸吸干并称重 ,然后迅速垂直于心脏长轴切取心肌组织 ,滴加 OCT包埋剂后置于液氮冷冻20 秒后转入冰冻切片机恒温箱 ,切取7μm厚的冰冻切片置于 - 70 ℃超低温冰箱备用。

1.2.3 　心肌冰冻切片的免疫荧光染色

       由于 Cx43 在心肌细胞膜上表达 ,为了更好地定位 ,采用双荧光标记 ,用红色荧光标记细胞膜 ,绿色荧光标记 Cx43 ,具体步骤如下: 1 将 - 70 ℃超低温冰箱保存的冰冻切片取出 ,室温复温 30 分钟后入4 ℃丙酮固定 10 分钟 ,PBS 漂洗 5 分钟 ×3次; 2100μg/ml 的得克萨斯红标记的麦芽凝集素 美国 Invitrogen公司 室温孵育 45min ,经 PBS漂洗 5 分钟 ×3 次; 3 10 %正常山羊血清封闭 ,室温孵育10 分钟;4 倾去血清 ,勿洗 ,滴加1∶50 稀释的兔抗大鼠 Cx43美国 Zymed 公司 ,4 ℃过夜 ,PBS 漂洗 5 分钟 ×3次; 5 滴加 1∶100 稀释的 FITC 标记羊抗兔 IgG,37 ℃孵育1 小时 ,PBS漂洗 5 分钟 ×3 次; 6 60 %的缓冲甘油封片。

1.2.4 免疫荧光图像的采集和分析

      实验使用Leica AS MDW多维成像工作站采集免疫荧光图像 ,所有图像均以同一曝光时间及相同条件采集。每张切片左、右心室各随机选取心肌纵切视野5 个 ,将数字化图像储存于计算机。应用JD801 形态学图像分析系统进行图像分析 ,测定 Cx43 的积分光密度 intergrated optical density, IOD ,以 IOD的大小代表 Cx43 量的多少 ,对其进行定量分析。

1.2.5 统计学处理

      所有数据均用 SPSS1210 软件包统计分析。组间进行单因素方差分析 ,结果均以平均数 ±标准差表示 , P <0105 为显著性水平 , p <0101 为非常显著性水平。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌 Cx43 免疫荧光图像

      图1 为正常心室肌纵切图 ,黄色或绿色的短杆状或小斑点状荧光斑代表Cx43 ,可见有Cx43 分布于心肌细胞的端对端连接处 闰盘 和侧对侧连接处 ,尤以端对端连接处的 Cx43 荧光斑面积大、亮度高。一次力竭运动和反复力竭运动各时相组与安静对照组比较,荧光斑的数量、面积和亮度均低于对照组,尤其在闰盘处的荧光斑,这种差异更明显;而且荧光斑的分布模式有明显变化,力竭运动后在心肌纤维端对端连接处的荧光斑的数目有所减少,侧对侧连接处的荧光斑差异不明显,也就是说心肌 Cx43 的分布由端对端连接处占优转变为以侧对侧连接处分布为主（图2、图3）。左、右心室之间对比未见明显差异。

2.2 大鼠心肌 Cx43 的免疫荧光图像定量分析

2.2.1　一次力竭运动后不同时相大鼠心肌 Cx43 的含量

       如表1 所示 ,一次力竭运动后各时相组左心室Cx43含量均显著低于安静对照组 P < 0105 ,并且运动后各时相呈先下降后上升再下降的趋势 ,运动后12 小时组显著高于运动后即刻组 p < 0101 ,其余各时相组之间无显著性差异 p>0105 。一次力竭运动后各时相组右心室 Cx43 含量均显著低于安静对照组 P < 0101 ,并且运动后各时相呈先下降后上升再下降的趋势 ,但各时相组之间无显著性差异 （p>0105 表1） 。

2.2.2 反复力竭运动后不同时相大鼠心肌 Cx43 的含量

        如表1 所示 ,反复力竭运动后各时相组大鼠左心室 Cx43 含量均显著低于安静对照组（ P < 0101 ）,运动后各时相呈先下降后上升的趋势 ,但各时相组之间无显著性差异。

        反复力竭运动后各时相组大鼠右心室 Cx43 含量均显著低于安静对照组 P < 0101 ,运动后各时相呈先下降后上升的趋势 ,但各时相组之间无显著性差异（ p>0105 表1 ）。

2.2.3 两种不同力竭运动后左、右心室 Cx43 含量比较

      一次力竭运动后12 小时组左心室 Cx43 含量高于反复力竭运动后 12 小时组 ,但无统计学意义（P>0105） ,在运动后即刻组、运动后 6 小时组和运动后24 小时组 ,右心室 Cx43 含量在不同形式运动中也无统计学差异（ P>0105 表1 ）。

一次力竭运动后 6 小时组右心室 Cx43 含量高于反复力竭运动后6 小时组 ,但无统计学意义 P >0105 ,而在运动后即刻组、运动后 12 小时组和运动后24 小时组右心室 Cx43 含量在不同形式运动中并没有统计学差异 （P >0105 表1） 。